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猪切口腹壁疝修复模型下交联及非交联生物网塞组织学及生物力学评价

来源:   时间:2018-12-10
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采用补片的无张力疝修补术是20世纪末划时代的手术,被誉为20世纪疝修补手术的“里程碑”。

理想的腹壁缺损修补材料要有相当的机械张力,耐受感染,尽量减少切口疼痛、局部不适、切口感染、血清肿、肠粘连和腹壁肠漏等较难处理的后遗症发生,以免影响生活质量。

疝和腹壁外科使用修补材料的研究进展与学科发展密切相关。近年来,各类生物源性材料的疝修补片(biological mesh)不断涌现,由于其植入后不引起强烈的炎症反应,有可吸收、可降解的特点,且具有可观的抗拉伸强度及耐受感染能力,应用前景良好。

但是由于生物补片在体内会逐步降解,如果生物补片的降解快于宿主细胞浸润细胞外基质、细胞分裂、胶原沉着和新生血管形成,那么新形成组织的总体量和强度将不能充分达到腹壁修补的目的。

之前,我们介绍了一篇美国国立卫生研究院于2013年发表的关于生物材料强度方面研究的文献进行了解读,今天我们选取另外一篇文献提供参考。

美国国立卫生研究院,简称NIH,位于美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda),是美国最高水平的医学与行为学研究机构,初创于1887年,任务是探索生命本质和行为学方面的基础知识。

注:由于水平有限,翻译中有错误之处,万望海涵。

猪切口腹壁疝修复模型下交联及非交联生物疝补片组织学及生物力学评价

摘要

研究背景——本研究的目的是对交联生物疝补片(Peri-Guard,Permacol)及非交联生物疝补片(AlloDerm,Veritas)进行生物力学性能及组织学重构特性评价。评价模型为猪的切口腹壁疝,评价周期为12个月。

研究设计——在48只Yucatan小猪的双侧腹壁制造切口疝,21天后应用衬垫方式进行修补。样品分别与置入后1个月,6个月,12个月取出进行生物力学及组织学分析。取出的样品分别与未植入的样品及植入部位的腹壁组织进行生物力学性能对照。统计显著性水平由Fisher最小显著差检验后的方差分析确定。

结果——经所有修补部位在1,6,12个月都呈现出相似的拉伸强度,所有植入疝补片材料没有显著性差异(P>0.05)。无论植入材料的初始强度如何,植入部位的猪腹壁组织在所有时间点没有呈现强度增加。在组织学上,相比于交联过的材料,未交联的材料呈现出更早期的细胞长入(P<0.01)、细胞外基质沉积(P<0.02)、疝补片支架降解(P<0.05)及新血管形成,而交联材料在植入12个月以后上述特性也都可呈现。

结论——应用生物疝补片进行疝修补,局部拉伸强度不受材料初始强度及材料是否交联等特性影响。虽然经过交联的材料在植入后短时间内其组织学特性如细胞长入、新血管形成等组织学特性有所差异,长时间以后这些差异基本消失。除了交联以外,材料来源的组织类型及处理条件等也会对这些差异造成影响。

在腹壁切口手术中20%的患者会因为切口疝产生并发症【1-3】。简单缝合会造成不可接受的31%到54%的复发率【4-5】。采用人工合成的网状材料可以使复发率降低2%到36%,目前已经成为切口疝的标准修复方式【4-7】。然而,任何人工材料植入本身就可能形成新的并发症,首次切口疝修复后伤口感染的机率可高达5%-30%【8】。管理术后感染有时需要将人工材料取出,这会造成疝的复发,从而需要进一步处理。近期在临床上防止感染的新材料使用量剧增,这些材料在高风险感染的伤口部位使用可以尽可能减少并发症。目前还没有一种材料可以适用于所有情况。然而,近期新型生物材料的研发展现出很好的前景,这些材料可以使用在伤口污染严重的部位。

脱细胞的生物材料一般来源于人体或者动物的表皮、小肠粘膜、心包,是一种新型的植入材料。经过脱细胞和去除免疫原性处理以后,只剩下细胞外基质框架,有利于宿主细胞本身的长入【9-10】。一旦被植入人体,随着宿主胶原在材料上的沉积,材料的细胞外基质就逐渐被降解,材料的重构由此开始。由此,生物材料作为疝修复补片可以保持足够的力学性能以防止疝的复发。一些生物材料经过交联处理可以有效抵抗在体内的降解。虽然一些临床前研究给出了一些交联和未经交联材料的特性【11-17】,目前在人体上这些材料在疝修补方面的长期临床数据还没有。

本研究的目的就是在猪的切口疝模型下对比交联和非交联生物材料对组织修复重建的影响。由于材料来源和交联处理工艺的不同,我们可以看到它们在材料的物理性能和宿主组织对它们的反应方面都有不同,我们在这些材料植入1,6,12个月分别取出进行了研究。

方法

本研究在华盛顿大学动物医疗委员的允许情况下展开。48只雌性Yucatan小猪被用来进行实验,它们采用特定的规程进行饲养和处理。手术中有严格的无菌环境。本研究中涉及的生物材料包括, Peri-Guard (交联牛心包)、 Permacol (交联猪皮)、Veritas (未交联的牛心包)、AlloDerm (未交联的人皮)。

采用双侧腹壁切口的方式制造Yucatan小猪的腹壁疝,21天后采用腹壁缝合的方式进行修补。切口长125px,切开表皮、皮下脂肪、筋膜和肌肉腱膜,但不切开腹膜。腹壁肌肉和筋膜保持开放。皮下脂肪和蜂窝组织进行3-0线间断缝合操作,表皮也同样缝合。表皮应用胶粘密封以防止内部流体在术后48-72小时流出。术后为防止感染,采用口服头孢氨芐,总共5天,每12小时20-25mg/kg体重。

腹壁缺损保留其自然生长21天,然后用8X250px生物补片修复。修复中遵循生产厂家的使用规范,打开腹壁缺陷到腹膜。双侧腹壁都进行修复,把补片放在腹膜前部,使其周围有更多的血管环境。补片按照长边方向250px,短边方向200px的方向放置。间隔约75px,距边至少25px的方式进行缝合。补片覆盖腹壁的重叠部分大约为2-75px。所有切口采用双层间断方式缝合。缝合后用表皮胶进行密封。术后防止感染处理同上所述。

在1,6,12个月的时间间隔,分别对动物实施镇静后处死。然后从中线打开腹壁,首先观察修复材料的表面状态。同时取下周围宿主腹壁组织,用以进行张力测试对比。修复的材料与宿主组织的交界处由于发生重构已经很难区分,我们取材时选用修复区域中间的修复材料。我们在进行材料测试时,不会刻意把生物材料单独分离出来,而是把修复地点的整个组织和材料一起取出作为样本。样品一般为4X100px大小,其中1X100px用于进行组织测试,余下的3X100px部分用于材料拉伸实验。

用特定的材料实验机进行测试,拉伸试验采用0.42mm/s的速率进行。材料可以承受的最大的在和用牛顿单位来度量(N),最大应力用最大的载荷除以材料的截面宽度获得(N/cm)。每个植入材料采用8个样本进行统计测量,猪的自体组织测量样本量为10,用以进行生物材料变化和猪自体组织之间的对比。

兽医病理医生采用特定方式制作样本用以进行组织分析。在5-10的区域中,在100倍放大的观察视野下对各种组织和材料变化做出分级,如宿主细胞渗透、细胞类型、材料细胞外支架分解、材料组织框架分解、纤维化覆盖程度、神经血管长入等等,然后给出一定的评分。分数高表明材料重构好,上述宿主细胞渗透、材料细胞外支架分解、材料组织框架降解、神经血管长入等效果优异,而且炎症反应水平低且纤维化水平低。每一种材料都会根据上述六种分类情况给出平均组织综合评价水平分数。

结果

生物补片材料的初始单向拉伸强度如下: Veritas, 89.6 ± 9.7 N; AlloDerm, 253.0 ± 15.2 N; Permacol, 317.2 ± 23.6 N; Peri-Guard, 169.5 ± 18.3 N (Fig. 1A)。忽略样品的厚度差异,应力强度为: Veritas, 29.9 ± 3.2 N/cm; AlloDerm, 84.3 ± 5.1 N/cm; Permacol, 105.7 ± 7.9 N/cm; Peri-Guard, 56.5 ± 6.1 N/cm (Fig. 1B)。初始强度方面,Permacol比其它材料都强很多,AlloDerm比Peri-Guard和Veritas要强,Peri-Guard比Veritas要强。

初始情况下四种生物材料的刚度也根据力和变形的弹性区域的斜率进行了计算。它们的刚度分别为: Veritas, 10.0 ± 1.3 N/mm; AlloDerm, 18.2 ± 1.3 N/mm; Permacol, 58.3 ± 4.0 N/mm; Peri-Guard, 34.8 ± 2.7 N/mm (Fig. 1C)。由此可以看出它们的显著差异。Permacol的刚度最大,Peri-Guard其次,AlloDerm第三,Veritas刚度最差。(刚度越大,表示在一定外力下越不容易变形)。

所有四种材料在植入前都比植入后1,6,12个月显著强度要大,而且刚性更大。此外,虽然四种材料在植入前强度和刚度有不同程度的差异,植入1,6,12个月后,这种差异变得不显著。

如图1所示,材料在植入后最大载荷的变化情况如下: 20-30 N,Veritas; 14-37N,AlloDerm;23-35N,Permacol;29-40N,Peri-Guard。拉伸应力的变化情况如下:7-10 N/cm,Veritas;5-13 N/cm,AlloDerm;7-12 N/cm,Permacol;9-14 N/cm,Peri-Guard。刚度的变化情况如下:0.9-2.6 N/ mm,Veritas,;0.6-3.6 N/mm,AlloDerm;1.1-5.8 N/mm,Permacol;1.9-5.8 N/mm,Peri-Guard。同样作为对比材料的猪自体腹壁材料的力学特性如下:最大载荷,10-17N;应力,3.4-5.6N/cm;刚度,0.8-1.1N/mm。在植入后的不同时间点,植入材料和自体组织材料的差别并不明显,初始强度和刚度更大的材料并不对应植入后材料强度和刚度的增加。

图1 生物材料随植入时间其力学性能的变化

组织学评价的差异体现出了材料的不同来源(例如表皮和心包)和是否交联。六个组织学评价的特征是:细胞渗透、细胞类型、细胞外基质分解、材料支架降解、纤维化覆盖程度、神经血管长入。对每一个样本,分别对这六种评价指标打分,然后每一种材料得到一个平均分。

从结果可以看出,两种未经交联的材料(Veritas和AlloDerm)在植入一个月后综合分数都高于交联的材料( Permacol和Peri-Guard)(图2),表明它们的重构特性更好。此外,植入一个月以后的评价分数来看,Veritas比AlloDerm分数更高。植入后六个月,两种未经交联的材料比两种交联过的材料的分数都高。每一种材料的评价分数都不会维持不变。所有四种材料的分数都会随植入时间的增加而提高。在所有考察的时间点上,Veritas都有最高的分数,相比于另一种未经交联的材料AlloDerm也是如此。

图 2 生物材料植入后的组织学综合评价分数

另外,组织学评价也显示出未经交联的材料初始情况下细胞渗透特性要强于交联材料。但植入6-12个月以后,这样的区别消失了(图3A)。此外,两种未经交联的材料在植入后一个月细胞渗透都达到峰值,此后6-12个月并没有显著增加。然而,两种交联材料在植入后细胞渗透特性会一致增强,而且在植入12个月后宿主细胞甚至可以长到材料的中间部位。

对长入细胞类型来说,在植入后1个月和6个月,相比AlloDerm,Peri-Guard检测到了更少的炎症细胞和更多的成纤维细胞,其他的参数对照差别并不明显。随着植入时间的推移,在所有四种材料中都观察到了更少的炎症细胞和更多的成纤维细胞。植入12个月时,Veritas的成纤维细胞最多而炎症细胞最少。

细胞外基质的分解在植入一个月后的未交联材料中明显高于交联材料,Veritas是最明显的,相比AlloDerm其次。在植入后6个月, Veritas, AlloDerm和 Permacol都比PeriGuard显示出更多的细胞外基质分解。然而植入后12个月,只有Veritas体现出了最高水平的细胞外基质分解。值得强调的是,除了Veritas,其他三种材料的细胞外基质分解指标在植入1和6个月时都是稳定增加而没有显著区别,并未显示出材料来源和是否交联的差别。(图3C)

未交联的材料在植入后1个月6个月的分析显示出,其材料支架结构的降解明显快于交联材料。Veritas的材料支架降解最快,AlloDerm其次。在植入后12个月,Veritas仍显示出降解程度高于其他材料。在所有的植入时间点,Veritas都显示出了这样的特性(图3D)。只有Permacol在植入后12个月观察到其降解程度显著高于其植入1个月和6个月后。

纤维化覆盖程度的评价显示出,Veritas的分数更高,表明它的纤维化覆盖程度很低,这是植入后1个月的观察结果。植入后6个月,AlloDerm和Veritas的分数相似,它们的纤维化覆盖程度比交联材料都要低。然而,植入12个月以后交联材料显现出纤维化覆盖程度降低,显示出这样的过程可能反转了。在植入12个月以后,只有Peri-Guard的纤维化覆盖程度高于Veritas。(图3E)

最后,在植入1个月和6个月时,两种未交联的材料有明显的神经血管长入,而交联材料没有这样的显著现象发生。在植入12个月以后,Verita和AlloDerm这一指标明显好于Peri-Guard,但与Permacol相当。Permacol在植入6个月到12个月期间,神经血管长入有所增加,到12个月时,其程度与未交联的材料相当(图3F)。所有四种材料在植入后都显示出神经血管长入的特性,而且逐渐增加。每一时间点增加的情况可以在图4的照片中显示出。

图 3 组织学评分的分项结果

图4 苏木精-曙红染色结果(100X)

讨论

虽然市场上有14种生物材料的补片,然而对疝补片长期植入效果的对比评价却还没有。本研究利用动物腹壁修复模型对比研究了四种生物疝补片材在长期植入后的生物力学和组织学差异。虽然生物材料更适用于伤口污染的情况,然而本研究还是在清洁环境下使用。材料在有菌情况下的使用不包含在本研究内。

我们开始认为腹壁修复的强度会随所选择植入材料初始强度的增加而增加。令人意想不到的是,没有一种修复材料植入后其强度显著强于猪的自体腹壁,这样的结果表明植入材料并不能增加腹壁的修复强度。然而我们并没有分析对比不用补片直接缝合修补的情况,可能在伤口愈合部位,补片还是会增加修复的强度。此外,虽然四种材料显示了不同的初始强度,在植入1个月,6个月,12个月,它们的强度就都没有明显差别了。总之,材料的初始强度似乎和修复时间长度没有关联。

修复位置对强度的影响也似乎关系不大。这可能显示出材料本身的支架降解过程中新的组织长入了植入材料,所以材料强度不会随植入时间而减弱。除了应力特性以外,材料的初始刚度也是影响修复的因素。刚度可以简单的描述为材料抵抗外力的变形(拉伸)程度。在疝修复应用中,材料需要抵抗腹壁隆起和疝的复发。然而修补材料的刚度不能过大,刚度过大的材料会由于无法拉伸而导致患者在呼吸、弯腰时感觉不舒服。我们的一些列测试表明材料的刚度与猪的自体腹壁组织材料并没有明显差异。虽然四种材料的初始刚度有差别,在植入1个月,6个月,12个月时差别基本消失。总之,材料的刚度差别也不会由于植入时间不同而影响修复,对刚度最大的材料Permacol也是如此。同样的,初始刚度很小的材料(AlloDerm和Veritas)也没有发生明显的修复后腹壁突起或疝的复发。

应该注意到,生物材料都是胶原材料,其刚度取决于其测量时的应变水平。应变是材料伸长量和初始长度的比值。小应变情况下,胶原材料的刚度和大应变下是不同的。高应变区域材料受到的载荷也接近达到峰值,可以解释为腹壁的大抻拉时材料产生大变形。在本研究中,AlloDerm的初始刚度明显大于Veritas。然而,本研究得到的刚度数据实在大应变下得到的。很多小载荷产生的小应变情况没有考虑,这可能也是有些弹性比较大的材料(如表皮)表现出比其他材料(如心包)的刚度更小。

在评价重构特性时,我们采用了综合组织学指标评分的方式对比不同的材料。结果显示,未交联的材料比交联的材料有更好的重构性。两种未交联的材料中,Veritas的综合评分要高于AlloDerm,而且大多数分项指标也有明显的优势。这个综合评分参考了6项重要的材料重构中组织学特征,可以反映出材料在修复过程中的表现。当我们需要综合考虑时,结合六项而不是孤立指标的分析是非常重要的。例如,在材料支架降解和细胞渗透以及新的组织血管长入方面需要平衡。当植入材料的组织支架无法检测到时,我们就认为它已经降解了。如果没有其他指标总额和分析,仅仅凭材料的组织框架降解并不能反映重构程度。综合细胞外基质分解指标才能反应重构程度。目前还无法评价细胞外基质分解和植入材料降解之间的比例对长期疝修复的影响。

组织学分析还反应了Veritas在植入后1个月的评分最高,此后6个月12个月的分数基本没有变化,除了长入细胞类型和神经血管长入持续的增加。AlloDerm和Veritas的趋势基本一致,在植入早期也获得了很高的分数而且以后变化不大。这两种未降解材料的组织学评价差异主要是细胞外基质分解以及材料组织支架降解方面有所不同,Veritas在这两方面的分数要高于AlloDerm。这样的差别显示出不同的材料来源(心包和表皮)以及其他处理/灭菌工艺会对材料的这些特性造成影响。然而,其他特性,比如细胞渗透长入、修复处长入细胞类型以及神经血管长入方面材料的这些差异影响不大。

交联材料(Peri-Guard和Permacol)的组织学评价分数比未交联材料的要低,特别是在植入后1个月。然而随着植入时间的增加,这些差别逐渐消除。例如,Peri-Guard和Permacol在植入1个月和6个月都显示出细胞渗透的增加,在6个月的时候基本和未交联材料程度一致,一致保持到12个月。结果表明,交联材料在初始阶段对细胞长入有阻碍,而所有的4种材料在随后的时间段细胞渗透情况基本相同。也就是说,长期来看,交联并没有影响细胞渗透长入。

一般来说,交联材料在植入12个月的时间段内所有组织学评价分数都有所增加。在植入后12月,交联材料的评价分数与AlloDerm基本一致,Veritas的而分数最高。这说明除了交联以外,其他因素,诸如材料来源和其他处理工艺也会在动物实验模型中体现出对长期植入的影响。

对未交联材料,在植入1个月和6个月后,其材料支架降解程度都比交联材料要高。这个结论支持交联工艺使得材料在短时期内抵抗降解的说法,因为它增加了材料的胶原结构连接。未交联材料中,Veritas 相比AlloDerm更容易降解,说明除了交联以外,还有其他因素也会影响材料的支架降解速度。Veritas, AlloDerm, 和 Peri-Guard在植入后1个月达到材料支架降解的最大值, 只有Permacol在研究的整个植入阶段降解程度在不断加大,表明不同交联的方式也会对材料的降解速度产生不同的影响。

同样地,未交联的材料在植入后1个月和6个月其纤维化覆盖程度要比交联材料轻,表明交联使得植入后短期内材料受到宿主的排异反应更大。所有四种材料中,Veritas的纤维化覆盖程度是最低的,而且不随植入时间的增加而变化。其他三种材料在植入开始阶段都体现了一定的纤维化覆盖程度,随着植入时间的推移,纤维化覆盖程度有所降低。最终12个月时只有Peri-Guard的纤维化覆盖程度要高于Veritas,其他两种材料和Veritas相当。这样的结果表明,纤维化覆盖的过程是可以反转的。虽然交联材料使得其初始造成纤维化覆盖程度增加,在植入6个月以后,该过程反转,到12个月时,和未交联材料的纤维化覆盖程度基本相当。Peri-Guard材料在所有植入时间段纤维化覆盖程度都比较高,这表明除了交联以外的其他因素可能也会影响宿主对材料的排异。

总之,实验数据分析表明,虽然交联的差异使得材料在组织学上与未交联材料有一定差异,如细胞渗透,神经血管长入等,长期植入后,这些差异基本消失。有可能其他一些因素,包括材料来源,其他处理工艺(脱细胞和灭菌工艺等)也会影响材料长期植入后的生物相容性。虽然交联工艺对生物材料支架的降解特性影响较大,但是否交联也不能作为影响修复区域强度和刚度的单独评价标准。

结论

本研究识别了四种生物材料的不同特点。由于影响因素众多,每个患者对材料的生物学反应也有个体差异,加上临床操作的不同,但很难给出哪种材料在腹壁修复中具有更好的生物相容性的结论。今后的研究还将着重对比材料来源以及除了交联工艺之外的其他工艺差别的影响,如脱细胞和灭菌工艺。